豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒使用操作說明書

日期：2022-07-05　|　中海生物技術(shù)文庫　|　瀏覽：2372 次

【名稱】

【作用與用途】

豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒（Blocking ELISA Kit For Classical Swine Fever Virus Antibody test）用于檢測豬血清中的CSFV特異性抗體，評估養(yǎng)豬場CSFV疫苗免疫狀況以及感染豬的血清學(xué)輔助診斷。

【檢測原理】

本試劑盒采用阻斷ELISA法，在酶標(biāo)板條微孔上預(yù)包被豬瘟病毒抗原。在實驗中，加入樣品稀釋液和待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有CSFV特異性抗體，則與包被板上抗原結(jié)合。經(jīng)洗滌后除去未結(jié)合的抗體和其他成分后，再加入酶標(biāo)抗體，樣本中的抗體阻斷了酶標(biāo)抗體與包被板上的抗原結(jié)合。再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，在微孔板中加入底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450 nm波長測定反應(yīng)孔中的吸光度OD值。

【主要成分與含量】

抗原包被板	1 板/2 板	底物 A 液	12 mL
陰性對照	2 mL	底物 B 液	12 mL
陽性對照	2 mL	終止液	12 mL
酶標(biāo)抗體濃縮液	0.24 mL	10×濃縮洗滌液	75 mL
酶標(biāo)抗體稀釋液	24 mL	蓋板膜	1 張/2 張
樣品稀釋液	15 mL	說明書	1 份

【需自備的材料】去離子水、微量移液器、酶標(biāo)儀（450 nm）、計時器、離心機（4000 rpm）等。

【用法與判定】

1、用法

1.1 試劑配制

洗滌工作液：使用前，濃縮的洗滌液應(yīng)恢復(fù)至室溫（20～25℃），并搖動，使沉淀溶解（最好在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中加熱 5～10 min），然后用蒸餾水作 10 倍稀釋（例如：75mL 的濃縮洗滌液加上675mL 蒸餾水）混勻，稀釋好的洗滌液 2～8℃可存放 7 日。

1.2 樣本處理

取動物全血，待血液凝固后，4000 rpm 離心 10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，無溶血。注：陰、陽性對照不用稀釋。

1.3 操作步驟

① 取抗原包被板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），設(shè)陰、陽性對照各 2 孔，取陰性、陽性對照各 100 µL 分別加入反應(yīng)孔中。其他孔加入樣品稀釋液 50 µL/孔，然后加入待檢血清 50 µL/孔。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，37℃避光反應(yīng) 30 min。 ② 棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液 300 µL，靜置1min 后，棄去洗滌液。洗滌 4 次后在吸水紙上拍干。

③ 配制酶標(biāo)抗體工作液:按體積比 1:100（1 份酶標(biāo)抗體濃縮液+99 份酶標(biāo)抗體稀釋液）混勻備用。

④ 每孔加酶標(biāo)抗體工作液 100 µL，蓋上蓋板膜，37℃避光反應(yīng)30 min。 ⑤ 棄去孔中的溶液，洗滌 4 次，方法同②。

⑥ 將底物 A 液與底物 B 液按 1:1 混合，加入孔中，100 µL/孔，蓋上蓋板膜，37℃避光反應(yīng) 10 min。 ⑦ 每孔加入終止液 50 µL，5 min 內(nèi)測定結(jié)果。

2、判定

在酶標(biāo)儀上讀各孔 OD450nm 值。

① 試驗成立的條件：

陰性對照平均 OD450nm 值≥1.0 且陽性對照 P（阻斷率）≥ I 50%，試驗結(jié)果才有效；否則，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗。

② 計算方法：

PI（阻斷率）=100%-(樣品 OD 值÷陰性 OD 均值)×100%

③ 陰陽性判斷：

PI≥40%時，判為陽性；PI＜40%時，判為陰性。

【注意事項】